Sephadex G-type 凝膠過濾填料

GE 的 Sephadex 系列的凝膠過濾填料是珠狀凝膠，它是葡聚糖和環(huán)氧丙烷偶聯(lián)介質(zhì)，擁有極高的選擇性。 不同型號具有不同分離范圍，顆粒大小不同。粗顆粒流速較快，細顆粒流速較慢，分辨率較高。

其主要應(yīng)用在低和高分子量分子間的分離。常常應(yīng)用于脫鹽、緩沖溶液的置換、去除一些生物大分子中的小分子，例如兩性電解物、去垢劑、放射性熒光標(biāo)記物、苯酚等等。

操作技術(shù)信息

1、洗脫液的選擇：

?洗脫液不會直接影響分辨率。

?為了避免離子的影響，洗脫液的離子強度應(yīng)該至少是 0.15M

?選擇的洗脫液要為樣品蛋白提供很好的溶解性和穩(wěn)定性。

?選擇合適的洗脫液常常能夠簡化后續(xù)的分離步驟。例如，為了后續(xù)的離子交換層析，可用開始的緩沖溶液平衡柱子。

2、洗脫液的準(zhǔn)備

?使用色譜級或分析級溶劑，鹽，和緩沖液

?用清潔玻璃器皿配制并存儲洗脫液

?洗脫液可用 0.22 μ m 的無菌過濾器過濾而且在使用前最好脫氣。

?不使用時在 4 ℃條件下存儲洗脫液，為了防止細菌生長，可以添加抗菌劑。

?低溫存儲的洗脫液應(yīng)放至室溫后再使用，以防止產(chǎn)生氣泡（如果在使用前洗脫液已儲存，建議可先除去氣體）

3、樣品制備

?當(dāng)使用的填料粒徑范圍為10-15 μ m時，樣品量≤0.5%柱體積；當(dāng)填料粒徑范圍為30-100μ m時，上樣量≤5%柱體積。

?在組分分離時，比如脫鹽，上樣量可達到 30 ％柱體積。

?當(dāng)重復(fù)實驗時，采用相同的方法制備樣品，保持樣品的濃度和體積不變。

?選擇的層析條件要保證樣品是穩(wěn)定的和可溶的。

?通過離心（例如，10 000g 離心 10min）或過濾去除樣品中的微粒（如果樣本是溶解在有機溶劑，一定要選擇耐有機溶劑的過濾器）

?如果樣品有較高的粘度，用洗脫液進行稀釋。（避免大于 30mg 蛋白/ml 樣品）

?在低溫下存儲樣品，除非這導(dǎo)致樣品析出或沉淀;避免長期存儲，除非可以存儲在-70℃

?使用蒸餾水

?使用色譜級或分析級溶劑，鹽，和緩沖液。

4、實現(xiàn)分離最優(yōu)化?

?樣品量—上樣量越少，分辨率越高。

?流速—高分子量物質(zhì)（蛋白質(zhì)），較低的流速有更好的分辨率。但對于低分子量物質(zhì)（小肽）與其相反。因為他們擴散速度較快，所以分離時間越長，樣品擴散區(qū)域越廣。

?柱長度—將兩個柱子串聯(lián)，可提高有效柱床高度。

?緩沖液的選擇和 pH 值通常影響較弱。然而，低 pH 值可提高疏水相互作用，在某些情況下常常能改善物質(zhì)分離（如肽類混合物的分離）